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不同非洲豬瘟病毒實驗室檢測方法的對比
更新時間:2019-03-08   點擊次數:6041次

不同非洲豬瘟病毒實驗室檢測方法的對比

 

一、簡介

非洲豬瘟(Africann Swine Fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)感染引起的家豬和野豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病1。臨床癥狀與豬瘟極其相似,以高熱、皮膚發紺、內臟器官嚴重出血、呼吸障礙和神經癥狀為主要特征。本病傳播快、致死率高,對養豬業危害巨大,是我國一類動物疫病和世界動物衛生組織(OIE)規定的必須報告的動物疫病,受到世界各國的高度重視2。本病是以節肢動物作為傳播媒介的DNA病毒。ASF已在非洲、歐洲和美洲等幾十個國家暴發,“三全水餃事件”則將非洲豬瘟直接推向大眾的面前。目前,本病尚無有效的預防疫苗和治療藥物,防止疫情擴大的有效措施就是撲殺。因此事先建立簡便、快速、準確的ASFV檢測方法顯得十分必要。本文ASFV實驗室檢測的不同方法,進行對比分析

二、檢測方法

2.1 血清學檢測方法

2.1.1酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

ELISA利用抗原抗體進行免疫反應的定性和定量檢測,應用于血清抗體的檢測,適用于大批量樣品的檢測。ASFV含有約150種蛋白,目前國內外常用作檢測抗原的蛋白有VP73、VP72、P54、P32、P30等3

優點快速、方便。

缺點:(1)一般情況下, 非洲豬瘟病毒進入豬體內, 7天后才能誘導產生較高的Ig G抗體,而7天的時候,足以出現早期臨床癥狀,并已經傳染給其他家豬,因此該檢測方法往往具有難以解決的滯后性。(2)針對不同蛋白會出現個別差異,增加排查的難度3

2.1.2膠體金免疫層析(GICA)試紙條

運用雙抗體夾心法原理純化后的抗ASFV單克隆抗體制備金標抗體, 應用于檢測ASFV的膠體金免疫層析試紙條,也稱為檢測卡

優點:使用方便;

缺點:(1)靈敏度低;(2)一般情況下, 非洲豬瘟病毒進入豬體內, 7天后才能誘導產生較高的Ig G抗體,而7天的時候,足以出現早期臨床癥狀,并已經傳染給其他家豬,因此該檢測方法往往具有難以解決的滯后性3

2.1.3熒光抗體試驗(FAT)

熒光抗體試驗(FAT)可用于檢測野外可疑豬或實驗室接種豬的脾、淋巴結等組織壓片和冰凍切片中的ASFV抗原。

優點敏感性和特異性較佳;

缺點:需要專業試驗人員,同時需要熒光顯微鏡及高質量的熒光標記抗體。因此僅作為ASFV的輔助檢測方法4

2.1.4免疫組化法

該方法用來檢測急性感染ASFV豬的扁桃體組織病理學變化,通過檢測發現,感染ASFV豬有出血、單核細胞增多現象。免疫組化法對于臨床癥狀不明顯的病例,確診有一定難度,因此,該方法僅作為ASFV的輔助檢測方法。

優點特異性較佳;

缺點:對于臨床癥狀不明顯的病例,確診有一定難度4

2.2分子生物學檢測方法

2.2.1 PCR

體外擴增基因的一種方法,是目前ASFV常用的實驗室檢測方法。研究表明,非洲豬瘟感染8小時, 便可從血液中檢測到其核酸物質,因此針對非洲豬瘟病毒保守區域設計引物,對采集的血液或組織病料等相關物質進行DNA提取,進行PCR反應,可對其進行快速準確診斷。是目前ASFV常用的實驗室檢測方法。眾多國內外研究5-9建立了ASFV的PCR檢測方法,表明該方法具有良好的敏感性和特異性,可以檢測出極低含量的ASFV,為ASFV早期感染的快速診斷提供了有效的分子生物學檢測方法。

優點:簡單快速、靈敏度高和特異性強

2.2.2 熒光定量PCR

通俗講是PCR的升級版。實時熒光定量PCR比常規PCR具有更高的敏感性和特異性,可同時快速檢測大批量樣品,其更加敏感、準確。舉例,McKillen等10(2010)根據9GL基因建立了MGB探針實時熒光定量PCR檢測方法,低可以檢測到20拷貝標準DNA。

優點:敏感性和特異性高。

2.2.3 探針雜交技術

能有效排除PCR檢測過程中的非特異性結果, 省去了瓊脂糖凝膠電泳步驟,操作簡便、檢測迅速,在酶標板中可批量反應,為ASFV核酸檢測方法開辟了新的途徑,

該方法的建立難度較高、操作較繁瑣, 對實驗人員技術水平要求較高。

三、小結

  • 目前,ASFV的檢測技術主要有針對病毒DNA的核酸檢測技術和基于病毒抗原、抗體反應的免疫學技術兩大類。
  • OIE推薦檢測ASFV的方法主要有PCR、實時熒光定量PCR、ELISA等。用免疫學方法檢測抗體可以了解ASFV感染、發生、發展的進程,但抗體只有在病毒感染至一定時期后才會出現,故ELISA等抗體檢測方法存在一定的局限性和滯后性
  • PCR、實時熒光定量PCR等分子生物學技術在豬感染ASFV的早期即可檢測到病毒核酸,在ASFV的早期檢測中具有重要作用。
  • 總之,ASFV的實驗室檢測方法多種多樣,但若要求檢測結果準確、快速、敏感,我們推薦PCR、實時熒光定量PCR的方法,這不僅對感染ASFV的動物治療非常重要,而且對未感染的動物及時采取有效的預防措施同樣具有重要的意義。
  • 隨著免疫學與分子生物學技術的不斷發展,ASFV的實驗室檢測方法必將不斷完善,進一步為我國開展ASF的監測與綜合防控提供技術支持。

 

 

【參考文獻】

1. 常華, 花群義, 段綱, 項勛, 曾昭文. 非洲豬瘟的研究進展. 中國畜牧獸醫 2007; 34 (1):116-118.

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3. 常華, 花群義, 段綱. 非洲豬瘟病毒的分子生物學研究進展. 微生物學通報 2007; 34 (3):572-575.

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7. Agüero M, Fernández J, Romero LJ, Zamora MJ, Sánchez C, Belák S, et al. A highly sensitive and specific gel-based multiplex RT-PCR assay for the simultaneous and differential diagnosis of African swine fever and Classical swine fever in clinical samples. Veterinary Research 2004; 35 (5):551-563.

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9. Basto AP, Portugal RS, Nix RJ, Cartaxeiro C, Boinas F, Dixon LK, et al. Development of a nested PCR and its internal control for the detection of African swine fever virus (ASFV) in Ornithodoros erraticus. Archives of Virology 2006; 151 (4):819-826.

10. Mckillen J, Mcmenamy M, Hjertner B, Mcneilly F, Uttenthal Å, Gallardo C, et al. Sensitive detection of African swine fever virus using real-time PCR with a 5′ conjugated minor groove binder probe. Journal of Virological Methods 2010; 168 (1):141-146.

 

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