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1.前言

循環游離核酸(circulating cell-free nucleic acids)是指存在于人體循環系統中，游離于細胞外的微量內源性或外源性核酸片段，包括核DNA、線粒體DNA(mitochondrial DNA，mitDNA)、病毒DNA、信使RNA(messenger RNA，mRNA)及微小RNA(microRNA，miRNA)等。1948年，Mandel等^［1］*發現了血液循環中游離DNA的存在。隨后，循環游離核酸在病理狀態下的特異性變化引起了廣泛關注。雖然這一發現十分重大，但當時并未引起人們的廣泛關注，并且在此后的很長一段時間里，人們也僅局限于研究游離 DNA 與人類自身免疫病之間的關系。1975 年，Steinman 在健康人的血漿中也發現有游離形式的核酸存在，這提示我們這種核酸的出現屬于病理學事件，而非病因學事件，但健康人血漿中游離 DNA 的量要顯著低于患有一定疾病的人。1977年，Leon等^［2］發現腫瘤患者血清中的游離DNA水平較健康人群明顯升高，并與腫瘤的進展與預后相關。1997年，人們發現在孕婦血漿中含有游離形式的胎兒源的 DNA，這使得血漿游離核酸的研究在胎兒出生前診斷方面的應用也有了快速的發展。1989年，Stroun等^［3］發現腫瘤患者血液中的游離核酸含有與腫瘤細胞相同的基因突變。現如今，游離核酸與腫瘤、妊娠相關性疾病、自身免疫病、移植排斥反應、創傷、急救醫學等有著密切關系，其檢測對疾病的早期診斷、分期、監測、預后判斷等有重要意義。

鑒于游離核酸的重要檢測意義，游離核酸的保存條件則直接決定了檢測結果的可靠性。為確保游離核酸標本檢測的準確性，本文采用了市面上常用的不同品牌游離核酸保存管，就保存效果進行了比較。

2 材料與方法
2. 1 材料

2.1.1保存管及分組

（1）E組：普通抗凝采血管（主要成分EDTA·2Na）；

（2）S組：Cell-Free DNA BCT（品牌：S公司，REF.2***52）；

（3）B組：Cell-Free DNA Storage Tube 10mL(品牌：Bioteke，REF. ST2001)；

（4）K組：Cell-Free DNA Storage Tube 10mL（品牌：K公司，Cat. CW***6S）。

2.1.2血液樣本

健康人血10ml。

2.1.3 試劑及設備

（1）Premix EX Taq （TaKaRa,Cat.RR390A）；

（2）探針及引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；

（3）Qubit dsDNA HS Assay Kit（Invitrogen by Thermo Fisher Scientific）；

（4）Beta-actin質粒由上海捷瑞生物工程有限公司合成；

（5）BioRad-CFX96(BIO-RAD, Foster city, California，USA），Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies，USA)，Mili-Q Advantage A10，SHZ-82A恒溫振蕩器（常州醫療器件廠）。

2.2方法

2.2.1血液樣本采集

采用標準靜脈穿刺采集年齡22-40歲健康人血10ml，各組年齡差異無統計學意義（P＜0.05），分別裝于采血管及保存管。

2.2.2血漿分離方法

輕柔上下顛倒混勻10次，800×g，20min，轉移上層血漿至1.5ml離心管；16,000×g，室溫，10min，轉移上層血漿至1.5ml離心管凍存-80℃備用。提取游離核酸前，室溫解凍，16,000×g，5min，吸取上層血漿，進行游離核酸提取。

2.2.3 游離核酸提取方法

     根據QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook 試劑盒操作說明操作。

2.2.4 Qubit熒光計定量血漿游離DNA的濃度

采用Qubit 2.0熒光計定量血漿游離DNA的濃度。

2.2.5 Beta-actin拷貝數的檢測

Beta-actin 10倍梯度稀釋10⁷-10¹，引物分別分actin-F1，actin-R1，探針為probe actin，引物及探針工作濃度為5 uM，20ul熒光定量體系引物加入量為各1ul。

擴增程序為50°C、5min，95°C、10min，循環50次， 95°C、20s，65°C、20s，72°C、 10min，結束。

 擴增程序試劑組成：

3 結果

3.1不同天數下（25°C）游離核酸保存效果的對比

    分別用3種不同的保存管（E、S及B）采集血液10ml，顛倒混勻15次后立即等分4份至無抗凝劑無促凝劑的玻璃采血管中，保存條件為25°C。分別于保存第0、3、7、14天時分離血漿，提取游離核酸。

圖 1不同保存天數下血液保存現象

 圖1 顯示：保存第7天和第14天，E組出現明顯的溶血現象，并隨時間的延長更加嚴重；S品牌產品保存的血液第7天略微有溶血現象，第14天時，溶血嚴重。相比之下，B品牌產品效果較佳。

圖 2  Qubit 檢測不同保存天數下每毫升血液cf-DNA濃度（ng/ml）

圖2 顯示：25°C條件下，E產品在第0天時，基因組基本無釋放；第3、7、14天的核酸量隨時間延長，基因組釋放量增加明顯；第14天的核酸檢測量是第0天的至少2500倍。 B產品的保存效果在14天之內，基本能夠抑制基因組的釋放；第14天的檢測結果為第0天的1.77倍。S品牌產品7天之內，能夠保持cfDNA穩定，基本無基因組釋放；但第14天檢測量劇增，是第0天的2200倍。

圖3 不同保存天數下每毫升血液Beta-actin拷貝數

圖3 顯示：Beta-actin定量結果趨勢與Qubit結果基本一致，室溫25°C保存3天，3種保存管的差異不顯著；保存第7天時，E與B組間的P Value<0.01，差異極顯著，B與S組 0.01<P value<0.05，差異具有顯著性；保存第14天時，B與S組P value<0.01，差異極顯著。

圖4 不同保存天數下每毫升血液cf-DNA濃度（ng/ml）

圖4Qubit結果顯示：三種保存管7天內保存效果無明顯差異，14天時，K組與S組保存管均出現明顯的上升，分別是第0天的15.27倍和10.21倍，21天時，上升較為明顯，分別是第0天的22.46倍和13.84倍。B組保護劑保存的血液在第0、3、7、14、21、28天檢測時，每毫升血液cf-DNA濃度均無明顯的上升。

圖5 不同保存天數下每毫升血液Beta-actin拷貝數

圖5Beta-actin定量結果與圖4基本一致。B2組保護劑保存的血液在第0、3、7、14、21、28天檢測時，每毫升血液Beta-actin拷貝數均無明顯的上升。

 3.2不同天數下（4°C）游離核酸保存效果的對比

圖6 不同保存天數下每毫升血液cf-DNA濃度（ng/ml）

圖6Qubit結果顯示：在4°C情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液cf-DNA濃度并無明顯的差異。

圖7 不同保存天數下每毫升血液Beta-actin拷貝數

圖7Beta-actin結果顯示：在4°C情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷貝數并無明顯的差異。

3.3不同天數下（37°C）游離核酸保存效果的對比

圖8 不同保存天數下每毫升血液cf-DNA濃度（ng/ml）

圖8Qubit結果顯示：在37°C情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液cf-DNA濃度并無明顯的差異。

圖9Beta-actin結果顯示：在37°C情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷貝數并無明顯的差異。

3.4運輸環境（25°C）對游離核酸保存效果的影響

考慮到保存管有可能應用于樣品的長途或短途運輸，因此需用搖床模擬運輸環境對保護劑抑制細胞破裂的影響。S組、K組及B組分別采集血液一份，搖床設置180rpm，25°C，分別在0、3、7、14天檢測核酸濃度和beta-actin拷貝量。

圖10 不同保存天數下每毫升血液cf-DNA濃度（ng/ml）

圖10Qubit結果顯示：在25°C模擬震蕩情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液cf-DNA濃度并無明顯的差異。

圖11不同保存天數下每毫升血液Beta-actin拷貝數

圖11Beta-actin結果顯示：在25°C模擬震蕩情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷貝數并無明顯的差異。

4.討論

（1）從每毫升血液Beta-actin拷貝數及每毫升血液cf-DNA濃度兩個方面來驗證cf-DNA完整性，已在多篇文獻中^[4][5]得到驗證。

（2）室溫25°C下，保存3天時，3種保存管的差異不顯著；保存第7天時，E與B組間的差異極顯著，B與S組差異具有顯著性；保存第14天時，B與S組P value<0.01，差異極顯著。在室溫25°C下，B組較S組及E組，保存時間較長，效果較佳。

（3）室溫25°C下，三種保存管7天內保存效果無明顯差異，14天時，K組與S組保存管均出現明顯的上升，，21天時，上升相對明顯。B組保護劑保存的血液在第0、3、7、14、21、28天檢測時，每毫升血液cf-DNA濃度均無明顯的上升。在室溫25°C下，B組較S組及K組，保存時間較長，效果較佳。

（4）在4°C情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷貝數及每毫升血液cf-DNA濃度并無明顯的差異。在4°C下，B組、S組及K組，保存效果無明顯差異。

（5）在37°C情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷貝數及每毫升血液cf-DNA濃度并無明顯的差異。在37°C下，B組、S組及K組，保存效果無明顯差異。

（6）在25°C模擬震蕩情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷貝數及每毫升血液cf-DNA濃度并無明顯的差異。在25°C模擬震蕩情況下，B組、S組及K組，保存效果無明顯差異。

5.參考文獻

[1]MANDEL P, MÉTAIS P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme ［J］. C R Acad Sci Paris, 1948,142: 241-243.

[2]LEON S A, SHAPIRO B, SKLAROFF D M, et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy ［J］.Cancer Res, 1977, 37(3): 646-750.

[3]STROUN M, ANKER P, MAURICE P, et al. Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients［J］. Oncology, 1989, 46(5): 318-322.

[4]Norton S E, Lechner J M, Williams T, et al. A stabilizing reagent prevents cell-free DNA contamination by cellular DNA in plasma during blood sample storage and shipping as determined by digital PCR[J]. Clinical Biochemistry, 2013, 46(15):1561-5.

[5] Ryan W L, Fernando R M, Das K. BLOOD COLLECTION DEVICE FOR STABILIZING CELL-FREE PLASMA DNA:, WO 2013123030 A3[P]. 2013.